蛋白質(zhì)含量的測定是生物化學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)以及食品科學(xué)等多個領(lǐng)域中不可或缺的基本實驗步驟。準(zhǔn)確測量蛋白質(zhì)濃度對于保證下游實驗如Western Blot、ELISA、免疫沉淀等實驗結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。
1、Bradford法（考馬斯亮藍(lán)）：Bradford法基于蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250染料在特定條件下形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其z大吸收峰會發(fā)生顯著變化，通過分光光度計測定吸光值的變化即可計算出蛋白質(zhì)濃度。
（1）實驗準(zhǔn)備
- 準(zhǔn)備不同已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
- 配制Bradford試劑（市售即用型或按廠家說明配制）。
（2）操作步驟
- 取若干微孔板，每孔加入一定量待測蛋白樣品及一系列標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。
- 向各孔加入等體積的Bradford試劑，混勻后在室溫靜置一段時間（通常為5-10分鐘）。
- 使用分光光度計在595nm波長下測定各孔的吸光值。
- 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、BCA法：基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，BCA鰲合Cu+作為顯色劑，產(chǎn)生藍(lán)紫色并在562nm有吸收峰，單價Cu+與蛋白質(zhì)呈劑量相關(guān)性?？梢愿鶕?jù)待測蛋白在562nm處的吸光度計算待測蛋白濃度。
(1)實驗準(zhǔn)備
- a. 取0.8ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制后可立即使用，也可以-20oC長期保存。
- b. 取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980μl稀釋液即可配制成 0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用0.9% NaCl或PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20oC長期保存。
(2)操作步驟
- a. 將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分 別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。
- b. 加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl，需加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到20μl。請注意記錄樣品體積。
- c. 各孔加入200μl BCA工作液，37oC放置20-30分鐘。 注: 也可以室溫放置2小時，或60oC放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反 應(yīng)會因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時間。
- d. 用酶標(biāo)儀測定A562，或540-595nm之間的其他波長的吸光度。
- e. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。 3、凱氏定氮法 它是通過測定樣品中的總氮含量間接反映蛋白質(zhì)總量的一種方法，因為蛋白質(zhì)含氮量相對恒定（約16%）。當(dāng)樣本與濃硫酸共熱，蛋白氮轉(zhuǎn)化為銨鹽，在強(qiáng)踐行條件下將氨整出，用加有指示劑的硼酸吸收，z后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定硼酸，通過標(biāo)準(zhǔn)酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 總結(jié)來說，不同的蛋白含量測定方法各有優(yōu)劣，選擇合適的方法取決于實驗需求、靈敏度要求以及可能存在的干擾因素。在實際操作時，務(wù)必遵循安全操作規(guī)程，并對實驗結(jié)果進(jìn)行必要的校正和驗證。
樣本量要求：3-5g或者5-10mL，為防止蛋白樣品降解，需低溫寄送保存，避免反復(fù)凍融。
服務(wù)周期：一般為樣品接收后的1周，具體實驗周期及送樣時間請與e測試工作人員溝通確認(rèn)，謝謝！
交付內(nèi)容：提供原始數(shù)據(jù)及圖片。結(jié)果反饋請在測試完成一周內(nèi)，不建議回收樣品，如有需要請?zhí)崆胺答伣oe測試工作人員。
用凱氏定氮法測試蛋白，如果同時有兩種蛋白怎么換算？
同時含有多種蛋白質(zhì)，且折算系數(shù)不相同時可以按復(fù)合配方食品換算蛋白質(zhì)系數(shù)。凱氏定氮法經(jīng)典、準(zhǔn)確，適用于食品中蛋白質(zhì)的測定。但是因樣品中一般會含有一些非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以凱氏定氮法測定結(jié)果為樣品中粗蛋白質(zhì)含量。然而，此法實際上測的不是蛋白質(zhì)含量，而是通過測氮含量來推算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。
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